木本植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因素

文章作者：騰昊科技發(fā)布時間：2021-09-07 15:57:49 瀏覽次數(shù)：5937次

一、基本培養(yǎng)基

在對植物進行組織培養(yǎng)研究時，首先需考慮培養(yǎng)基選擇的問題，而基本培養(yǎng)基的選擇是在研究中優(yōu)先被考慮?，F(xiàn)今，依照基本培養(yǎng)基的成分與元素的濃度，大致分為4個類型：富集元素平衡培養(yǎng)基(包括 MS、LS、BL、ER等)，高硝酸鉀含量培養(yǎng)基(包括 B5、N6、SH等)，中等無機鹽含量的培養(yǎng)基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低無機鹽培養(yǎng)基(包括White、WS、HE等) 。在絕大多數(shù)的植物組織培養(yǎng)中，通常選擇MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，但也需要參照目標(biāo)植物的近緣物種的相關(guān)研究成果進行選擇基本培養(yǎng)基。不過，在一般情況下，植物能夠適應(yīng)多種基本培養(yǎng)基，但不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)目的，選擇最佳的基本培養(yǎng)基不同。

在對麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究中，以幼胚為外植體，去除胚乳，接種MS、LM、WPM、N6 4種未添加任何植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)N6早生出胚根，而MS與WPM能夠大量誘導(dǎo)出愈傷組織，并且WPM培養(yǎng)基上的分化不定芽數(shù)量最多，在不定芽生根中，以LM與WPM培養(yǎng)基的生根誘導(dǎo)率最高，不過WPM培養(yǎng)基上的主根較少，側(cè)根系發(fā)達，因此WPM培養(yǎng)基是最佳培養(yǎng)基。雖然基本培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)中起到支撐作用，但各種培養(yǎng)基都包含了植物生長所需的基本元素，只是其濃度比例不一，并且在實際培養(yǎng)中仍需添加激素、抗氧化劑或一些物質(zhì)進行補充，使得培養(yǎng)效果達到最佳。

二、植物激素

在1905年德國植物學(xué)家Haberlandt提出植物細胞具有全能性的概念時，植物組織培養(yǎng)技術(shù)就已經(jīng)開始發(fā)展，不過其技術(shù)發(fā)展歷程十分艱辛與緩慢，很大的原因是當(dāng)時尚未發(fā)現(xiàn)對植物細胞生長分化起著促進作用，但其濃度很低的物質(zhì)，后來這類物質(zhì)被稱為植物激素。目前，天然植物激素因其主要的調(diào)控作用，被分為5類：生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸。由于天然植物激素在植物體內(nèi)含量極微，因此想從天然來源提取激素十分困難且不經(jīng)濟。在了解天然植物激素化學(xué)結(jié)構(gòu)后，現(xiàn)如今已經(jīng)可以大量人工合成植物激素，并對原有結(jié)構(gòu)進行改變，制成活性更強的植物激素類似物，如常用的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)與KT(激動素)等物質(zhì)。自植物激素運用以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷實現(xiàn)對不同品種植物的離體再生，獲得完整植株。

1 生長素

生長素是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物內(nèi)源激素，參與了植物根和莖的發(fā)育、器官的衰老與維管束組織的形成等方面的植物生長分化過程。在植物組織培養(yǎng)研究中，常用的生長素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2，4-D，其中以2，4-D的活性最強，濃度過高，易引起遺傳變異。并且過高的生長素濃度會對木本植物誘導(dǎo)芽增殖起到抑制作用。

在對不同生長素影響喜樹組培苗生根的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA比NAA對誘導(dǎo)生根效果要好，但兩者濃度過高都會對生根造成抑制效果，最佳的濃度為IBA 0.5 mg/L。而在對紅松的組織培養(yǎng)研究中，也獲得了相似的結(jié)果，在生長素類激素含量較高時發(fā)生不定根。在對棗樹愈傷組織形成的不定芽進行不定根誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低，并且仍會有大量愈傷組織生成，而2，4-D主要以愈傷組織誘導(dǎo)為主。

2 細胞分裂素

細胞分裂素是在組織培養(yǎng)中另一種重要的植物內(nèi)源激素，通常與生長素一起使用，兩者相輔相成，能夠達到更好的培養(yǎng)效果。細胞分裂素大致可分成兩類,一類是嘌呤型細胞分裂素(CTK),另一類是苯基脲型細胞分裂素(PUD)。植物組織培養(yǎng)中常用的第一類嘌呤型細胞分裂素，包括BA(芐基腺嘌呤,又稱 6-BA,BAP)，KT(激動素,KIT,KIN)，2IP(2-異戊烯基腺嘌呤)，ZEA(玉米素,即異戊二烯腺嘌呤,又稱ZT)。苯基脲型細胞分裂素是新型的細胞分裂素，其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一種植物激素，因具有高度的細胞分裂素活性，也常被使用。在對紅松和棗樹的組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)細胞分裂素BA對誘導(dǎo)不定芽的效果較好，不過BA會抑制不定根的產(chǎn)生。在防止酸櫻桃組培苗玻璃化的研究中，發(fā)現(xiàn)BA會提高玻璃化率，而KT對玻璃化無影響。在探討TDZ對于木本植物組織培養(yǎng)中的影響認(rèn)為，TDZ能夠促進許多再生困難的木本植物品種完成微繁殖過程，在濃度低于1 μmol/L時，能夠使腋芽增殖，但可能抑制芽的伸長;在濃度高于1 μmol/L時，能夠刺激愈傷組織的形成、誘導(dǎo)叢生芽與體細胞胚發(fā)生。

3 赤霉素

赤霉素至今已發(fā)現(xiàn)100多種，總稱為赤霉素類(GAs)。其中只有少數(shù)赤霉素對植物的生長發(fā)育具有生物活性，在木本組織培養(yǎng)的研究中應(yīng)用較多的是GA3。GA3的作用類似于生長素，但與其不同的是，GA3對完整植株的作用要強于對離體器官或組織的作用。GA3可刺激器官的生長，卻抑制器官的發(fā)生，如GA3對不定根的產(chǎn)生具有抑制作用，但在根原基形成以后，則不對不定根的發(fā)生造成影響。

在對龍眼和荔枝的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對兩者的愈傷組織誘導(dǎo)具有抑制作用，應(yīng)該省去不用。在對白木香組織培養(yǎng)技術(shù)及植株再生的研究中發(fā)現(xiàn)，GA3僅對種子萌發(fā)具有促進作用，其余誘導(dǎo)器官發(fā)生的部分都不宜使用。而在對于美國月桂櫻組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3對芽的伸長沒有效果。據(jù)相關(guān)報道，赤霉素能促進植物開花，但對于植物離體再生作用較小，尚沒有廣泛運用。

4 乙烯

乙烯是一種氣態(tài)的植物激素，廣泛存在于植物成熟的果實果皮中，對催化果實成熟有促進作用。而乙烯對于植物組織培養(yǎng)作用方面的研究尚少。都對乙烯在愈傷組織誘導(dǎo)、體細胞胚發(fā)生、不定芽與不定根的誘導(dǎo)等相關(guān)研究進行了概述，表明了乙烯在不同植物品種中具有起到的作用不一，而在木本組織培養(yǎng)中，乙烯的作用很少涉及。謝耀堅在對歐洲云杉胚性愈傷組織培養(yǎng)中乙烯的釋放及其作用的研究中，發(fā)現(xiàn)乙烯釋放量的變化對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率無明顯促進或抑制作用。乙烯在木本植物組織培養(yǎng)方面的作用仍需進一步研究。

5 脫落酸

脫落酸作為五大類激素之一，對植物細胞分裂擴增起著重要調(diào)控作用，而且經(jīng)常在組織培養(yǎng)方面，通過提高愈傷組織的干燥耐受性和防止提早發(fā)芽，從而促進體細胞胚的發(fā)生與提高體細胞胚的質(zhì)量。脫落酸不只調(diào)節(jié)植物細胞的生長發(fā)育，還在植物細胞受到脅迫時發(fā)揮作用。因此，脫落酸以其在植物生長發(fā)育中所起的獨特作用，近年來不斷受到科學(xué)家的青睞，研究深度與廣度逐步增加。

進行了脫落酸對棕櫚樹體細胞胚發(fā)生的影響研究，發(fā)現(xiàn)添加0.1 mg/L脫落酸時，促進的體細胞胚發(fā)生量最大，濃度過高則會減少體細胞胚的發(fā)生量。同樣以棕櫚樹為研究對象，發(fā)現(xiàn)運用懸浮培養(yǎng)方式，與添加50～100μmol/L的脫落酸濃度對同步化誘導(dǎo)體細胞胚具有促進作用。在利用未成熟的椰子種子為外植體，進行愈傷組織誘導(dǎo)后，以添加7.5 μmol/L的脫落酸濃度，體細胞胚發(fā)生量最大，但無法進一步萌發(fā)出芽，而5～5 μmol/L的ABA濃度，可以成功生出芽。

三、碳源

在對植物細胞進行組織培養(yǎng)時，除了需要添加植物激素，與基本培養(yǎng)基所提供的基本營養(yǎng)元素外，生長發(fā)育主要所需的能量物質(zhì)是由碳源物質(zhì)所提供的。碳源一般是糖類物質(zhì)，常用的碳源物質(zhì)有蔗糖、葡萄糖、果糖與半乳糖等。其中蔗糖與果糖，在植物組織培養(yǎng)中最為廣泛運用。碳源不只是為植物細胞提供能量物質(zhì)，還能為植物細胞提供滲透壓，提供細胞吸取養(yǎng)分的動力，而滲透壓與碳源的種類與濃度密切相關(guān)。

蔗糖是植物組織培養(yǎng)中，最常用的碳源物質(zhì)，屬于非還原性二糖。蔗糖在供能外，還能促進愈傷組織的再分化。由于植物細胞對蔗糖的吸收速率較慢，因此蔗糖能夠長期保持較穩(wěn)定的滲透壓，為植物細胞生長發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用，對微生物的污染有一定程度的減輕效果。

利用不同碳源對桑樹莖尖進行培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)果糖是桑樹誘導(dǎo)芽尖與繼代培養(yǎng)效果最佳的碳源，而葡萄糖可在繼代培養(yǎng)中替代果糖，達到更好的培養(yǎng)效果。利用不同碳源對獼猴桃的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖和葡萄糖對芽的分化效應(yīng)無明顯差異，不過低濃度的碳源不能很好地進行芽分化和生長，而高濃度的碳源雖能較好地誘導(dǎo)芽分化，但抑制了后期芽的生長。在植物組織培養(yǎng)中，一般多用蔗糖作為培養(yǎng)基碳源，對于個別植物的組織培養(yǎng)則以葡萄糖與果糖這些單糖作為碳源更佳。因此，對植物組織培養(yǎng)中碳源種類與濃度的選擇也是必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

四、pH值

pH值在植物組織培養(yǎng)研究中，通常代表著培養(yǎng)基中的酸堿度。大多數(shù)植物在離體培養(yǎng)中，pH值的要求5.0～6.2。適宜的pH值，是植物組織離體再生過程中能夠正常吸取生長養(yǎng)分的重要影響因素。并且pH值能夠影響培養(yǎng)基的凝固程度，當(dāng)pH較低(≤4.0)時，加入一定量的凝固劑，培養(yǎng)基都難于凝固。而培養(yǎng)基的凝固程度對培養(yǎng)物的支撐作用，對其保證正常生長發(fā)育具有重要意義。

在鈣離子與pH值對柚木組培苗生長和礦質(zhì)養(yǎng)分吸收影響的研究中發(fā)現(xiàn)，pH值對苗高生長及愈傷組織生物量積累有顯著影響，適宜pH值為6.0，只有穩(wěn)定在最適pH值上，增加鈣離子濃度，才會增加柚木組培苗的營養(yǎng)元素吸收。對3個越橘品種組培苗在pH值5～9條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同越橘品種在相同pH值條件下生長狀況不一致。因此，表明pH值是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，而且不同植物品種的最適pH值都有所不同。

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